特立帕肽(TPT)检测试剂盒说明书

仅供科研使用

禁止用于临床诊断

特立帕肽(TPT)检测试剂盒

(化学发光免疫分析法)

货号： FY-EU13956 规格：96T

使用本产品前请务必仔细阅读此说明书

如果有任何问题请联系我们

电话：	86-027-87002654
邮箱：	tech@feiyuebio.com
官网：	www.Feiyuebio.cn

使用目的

该试剂盒用于定量检测血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清和其他生物体液中的TPT浓度。

特异性

? 灵敏度：1.91pg/mL。

? 检测范围：5.49-4,000pg/mL。

? 在TPT及其类似物之间没有检测到显著的交叉反应。

? 重复性：变异系数<10%。

检测原理

将 TPT抗体包被于 96 孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的 TPT与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的 TPT抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 HRP 标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入底物。加入底物后会产生辉光型光信号。发射光强度和样品中的 TPT呈正相关。用化学发光仪测定相对光单位（RLU），计算样品浓度。

限制性

1. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

2. 由于其有效性的不确定性，该试剂盒可能不适合检测某些特殊的实验样品，例如基因敲除实验样品。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。

4. 不同厂家的试剂盒或通过其他方法检测相同的指标可能会产生不一致的结果

5. 由于试剂盒中使用的抗体通常是由重组蛋白作为免疫原制备而成，而重组蛋白可能会受限于不同的片段、表达和纯化体系，因此不建议使用此试剂盒来检测重组蛋白。

6. 为了获得最佳实验结果，请仅使用我们提供的试剂，并且不要混用不同批次的试剂。

7. 由于现有条件和科学技术的局限性，我们无法全面识别和分析供应商提供的原材料。因此，该试剂盒可能存在一定的质量和技术风险。

8. 在实验测试所有影响因素之前，不能排除干扰的可能性。

9. 为了获得可重复的结果，应严格控制实验中的每个步骤，样品收集、处理和存储的变化也可能导致样品测量的差异。

10.尽管每个试剂盒都通过了严格的质量测试，但由于运输条件和不同实验室设备等影响因素，可能会引起不同批次试剂盒之间检测值的差异。

试剂盒组份

组份	描述	存储条件
预包被微孔板	8孔× 12条	-20℃
标准品	冻干粉, 2支	-20℃
检测试剂A	120μL	-20℃
检测试剂B	120μL	-20℃
标准品/样品稀释液	20mL	2-8℃
检测试剂A稀释液	12mL	2-8℃
检测试剂B稀释液	12mL	2-8℃
洗涤液 (30x)	20mL	2-8℃
底物A	10mL	2-8℃
底物B	2mL	2-8℃
封板膜	微孔板封膜, 4张
使用说明	试剂盒操作说明, 1份

存储

1. 收到试剂盒后，未开封的试剂盒可在2-8℃下保存1个月。如果试剂盒在1个月内未使用，请在收到试剂盒后，将每个组件分别存放在上表中指示的温度下。

2. 使用试剂盒时，剩余试剂应按上表存储条件贮存。

3. 未使用的板条应立即放回装有干燥剂的铝箔袋中，重新密封并在-20℃下存储。

4. 所有试剂瓶盖必须拧紧，以防止蒸发或微生物污染，使用测量仪器量取体积，不能直接将试剂瓶内试剂全部倒出。

5. 包装盒上的标有产品的有效期，所有组份在有效期内保证稳定。

实验过程需自备的材料和仪器

多功能化学发光仪（参数：滞后时间 30s；读数时间 1s/孔）

37℃恒温箱

高精度单道或多道移液器

一次性移液器吸头

EP管

加样槽

洗板机

去离子水或蒸馏水

用于微孔板的吸水纸

注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 新打开的酶标板可能含有水雾样物质，此为正常现象，不会对实验结果产生任何影响。

3. 不得重复使用标准品工作液、检测试剂A工作液、检测试剂B工作液。

4. 本说明书也适用于48T试剂盒，但48T试剂盒的所有试剂均减半。

5. 溶解含有蛋白质溶液时，应始终避免起泡。

6. 为避免交叉污染，在每个标准品浓度加样之间、样品加样之间以及试剂加样之间更换移液器枪头。此外，应为每种试剂使用单独的储液瓶。

7. 为了得到准确的实验结果，在孵育过程中，必须确保封板膜将酶标板密封。

8. 在使用自动洗板机时，添加清洗缓冲液后，在清洗步骤之间添加30秒的浸泡时间可提高分析精度。

样品收集

血清：让血样在室温下凝结2小时或在2-8℃下过夜，然后在2-8℃下2000× g离心15分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃备用。

血浆：使用EDTA或肝素作为抗凝剂收集血浆。采集后30分钟内，在2-8℃、2000× g条件下离心样品15分钟，随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

组织匀浆：应在预冷的PBS中冲洗组织，彻底清除多余的血液，称重，切成小块。然后在冰上的采用玻璃匀质器在PBS（组织重量（g）：PBS（mL）体积=1：9）中均质化组织块。使用超声波细胞破碎机对所得匀质悬浮液进行超声处理，直到溶液澄清。然后将匀浆在10000× g下离心5分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

细胞裂解物：对于粘附细胞，用适量预冷的PBS轻轻清洗细胞，并用胰蛋白酶分离细胞。以1000× g离心5分钟收集细胞（悬浮细胞可直接离心收集）。弃上清，用冷PBS清洗细胞3次。在浓度为5×10⁶个细胞/mL的冷PBS中重新悬浮细胞。重复冻融数次，直到细胞完全溶解。1500× g，2-8℃离心10min。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

细胞培养上清和其他生物体液：在1500× g，2-8℃条件下离心样品15分钟。随后立即取上清液进行检测，或存储在-20℃或-80℃下备用。

注意事项

1. 样品2-8℃保存时应在6天内使用，否则必须在-20℃(≤1个月)或-80℃(≤2个月)保存。应避免反复冻融。

2. 测定前请预估样品浓度。如果样品浓度不在标准曲线范围内，用户必须通过预实验确定其实验的最佳样品稀释度，采用PBS进行稀释。

3. 如果样品没有在说明书中提及，则需要进行预实验以确定试剂盒的有效性。

4. 如果使用裂解缓冲液制备组织匀浆或细胞培养上清，则有可能由于所引入的化学物质而造成实验偏差。

5. 一些重组蛋白可能由于与包被抗体或检测抗体不匹配而不能被检测到。

6. 请不要使用溶血样品进行检测，因为这会影响检测结果。

7. 推荐采用没有长时间保存的新鲜样品用于实验。否则这些样品可能发生蛋白质降解和变性，最终导致结果错误。

试剂准备

1. 使用前将所有试剂平衡至室温(18-25℃)。

2. 洗涤缓冲液:用580 mL去离子水或蒸馏水稀释20 mL浓缩洗涤缓冲液，制备成600 mL洗涤缓冲液。

3. 标准工作液：首先，标准品1000× g离心1min，加入1mL标准品稀释液，使其静止10min再轻柔混匀，这就是 4000 pg/mL工作储备液。取7个EP管，每管内加入600μL标准品样品稀释液。吸取300μL 4000 pg/mL 标准品稀释液到第一个管内再混匀即为1333.33 pg/mL工作液。按照下图将300μL的溶液从前管移到后管中。在下一次转移前，将每管彻底混匀。设定7个梯度稀释标准品如 4000 pg/mL, 1333.33 pg/mL, 444.44 pg/mL, 148.15 pg/mL,49.38 pg/mL, 16.46 pg/mL, 5.49 pg/mL。最后1个装有标准品稀释液的EP管是空白对照作为0pg/mL。

4. 检测试剂A工作液：实验前计算所需量(100 μL/孔)。在准备工作中，应该准备比计算量稍微多一点（多100-200μL）。使用前将原液管离心，用检测试剂A稀释液将100×浓缩检测试剂A稀释至1×工作液（如：10μL检测试剂A + 990μL检测试剂A稀释液）。

5. 检测试剂B工作液：实验前计算所需量(100 μL/孔)。在准备工作中，应该准备比计算量稍微多一点（多100-200μL）。使用前将原液管离心，用检测试剂B稀释液将100×浓缩检测试剂B稀释至1×工作液（如：10 μL检测试剂B + 990μL检测试剂B稀释液）。

6. 底物工作溶液：将底物 A 和底物 B 按照 99：1 的比例轻轻混匀。如：制备 1,000μL 的底物工作液需要 990μL 的底物 A 加上 10μL 的底物 B，混匀。

7. 标准品、检测试剂A和检测试剂B只能使用一次。

操作步骤

1. 将标准工作溶液加入前两列，每个浓度设置一个复孔(每孔100 μL)。将样品加入其他孔中(每孔100 μL)。盖上试剂盒提供的封板膜。37℃孵育60分钟。

2. 弃去每孔中的液体，不洗板立即向每孔中加入100μL的检测试剂A工作液（现配）。盖上封板膜。37℃孵育60分钟。

3. 弃去每孔中的液体，每孔加入350μL洗涤缓冲液。浸泡60-120秒再倒出每孔中液体并在干净的吸水纸上拍干。重复这个洗涤步骤，共3遍。

4. 向每孔中加入100μL的检测试剂B工作液（现配）。盖上封板膜。37℃孵育30分钟。

5. 弃去每孔中的液体，重复步骤3的洗涤过程5遍。

6. 每孔加入100μL的底物工作液。盖上新的封板膜。37℃避光孵育10分钟。

7. 立即在微孔板型多功能化学发光仪上测量化学发光信号（RLU）值

典型数据

标准曲线的RLU值可能会由于具体实验条件不同而变化(例如，操作人员、移液技术、洗涤技术或温度影响)，因此强烈建议根据每次实验的具体数据绘制标准曲线。下面提供的典型标准曲线仅供参考。每个标准品和样品的重复读数分别取平均值，然后减去零孔RLU的平均值。拟合一条标准曲线，x轴为RLU值，y轴为标准品浓度。通过这些点绘制最佳拟合曲线，且其能通过回归分析确定回归方程。如果样品被稀释，从标准曲线上读出的浓度必须乘以稀释系数。

灵敏度

TPT的最低检测浓度通常小于1.91pg/mL。

本方法的灵敏度，或检测限(LOD)被定义为最低的可以区别于空白孔的检测指标浓度。其计算方法是20个空白孔的平均RLU值加3倍标准差，然后计算相应的浓度。

特异性

本方法对TPT的检测灵敏度高，特异性好。

TPT及其类似物之间未观察到明显的交叉反应。

受现有技术和知识的限制，我们不可能完成TPT与所有类似物的交叉反应性检测，因此交叉反应可能仍然存在。

回收率

下表列出的3种样品已添加一定水平的TPT，TPT的回收率通过比较检测值与样品中TPT的期望值来计算。

线性

三种样品添加适当浓度的TPT，并稀释成一系列浓度梯度, 然后通过比较检测浓度值和期望值的百分比来验证方法的线性。

简要步骤

1. 准备所有试剂

2. 加入100μL标准品和样品，37℃孵育60min

3. 弃去液体，加入100μL检测试剂A，37℃孵育60min

4. 弃去液体，洗涤3遍

5. 加入100μL检测试剂B，37℃孵育30min

6. 弃去液体，洗涤5遍

7. 加入100μL底物，37℃孵育10min

疑难解答

问题	可能原因	解决措施
标曲不好	标准品稀释不正确	确保标准品按照推荐方法溶解和稀释
	移液不准确	定期校准移液器并检查枪头密封性
	反应液蒸发	用封板膜密封酶标板
	洗板不彻底	足够的洗涤次数和加入足量洗涤液
	孔底有异物	读数前清洁板底
RLU值低	试剂反应不充分	确保孵育时间并按推荐温度孵育
	试剂体积添加不足	检查移液器并严格按照操作步骤操作
	稀释不正确	检查试剂稀释步骤
	酶结合物失活	混合酶结合物和底物，通过显色反应检查
样本值低	不正确的样本储存方式	正确储存样本，使用新鲜样本进行实验
	不正确的样本储存方式	采取正确的样本收集和处理方法
	待测物质在样本中含量低	使用新鲜样本，重复实验